煙草是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，但田間易受多種病害的威脅，其中根莖部土傳病害危害嚴(yán)重，導(dǎo)致煙草的產(chǎn)量和品質(zhì)下降，嚴(yán)重制約我國(guó)煙草產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。煙草上分布較廣的重要土傳病害包括煙草疫霉引起的黑脛病、假茄科雷爾氏菌引起的青枯病、立枯絲核菌引起的立枯病、尖孢鐮刀菌引起的根腐病以及基生根串珠霉引起的根黑腐病等，這五種病害發(fā)病早期隱蔽性強(qiáng)，發(fā)病癥狀比較類(lèi)似，并且待發(fā)病明顯時(shí)多已難以救治，田間很難從癥狀上準(zhǔn)確區(qū)分，容易導(dǎo)致誤診而無(wú)法有效控制病害蔓延。另外，土傳病害易發(fā)生復(fù)合侵染，增加病害診斷和防治的難度。因此，建立一種能夠在早期對(duì)多種煙草土傳病原菌進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、高效的檢測(cè)方法有助于控制煙草土傳病害帶來(lái)的嚴(yán)重?fù)p失。常規(guī)檢測(cè)方法主要是對(duì)病株進(jìn)行分離鑒定，其分離難度大，靈敏度低，耗時(shí)長(zhǎng)，難以滿(mǎn)足生產(chǎn)上的需求。血清學(xué)檢測(cè)易出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)且一次只能檢測(cè)一種病原。

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，已有很多PCR相關(guān)技術(shù)運(yùn)用在植物病害的快速檢測(cè)方面。如利用環(huán)介導(dǎo)等溫技術(shù)擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)了對(duì)假茄科雷爾氏菌的快速分子鑒定。利用巢式PCR實(shí)現(xiàn)了對(duì)煙草疫霉的快速鑒定。利用UP?PCR分子技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)立枯絲核菌的快速鑒定。利用比較基因組學(xué)的方法，建立了尖孢鐮刀菌的多重PCR檢測(cè)體系。用多重PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)煙草疫霉和煙草根腐病的快速檢測(cè)。但田間煙草土傳病原菌種類(lèi)較多，建立同時(shí)檢測(cè)更多病原菌種類(lèi)的技術(shù)將提高檢測(cè)效率和應(yīng)用價(jià)值。

多重PCR技術(shù)是在同一反應(yīng)體系中加入多對(duì)特異性引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的PCR反應(yīng)，其原理與常規(guī)PCR相同。在病害研究中，主要應(yīng)用于多種病原物的同步檢測(cè)。與常規(guī)PCR相比，多重PCR具有成本低、檢測(cè)效率高等優(yōu)點(diǎn)。目前也有運(yùn)用多重PCR檢測(cè)煙草病原菌的報(bào)道，但不同煙草種植區(qū)域病害種類(lèi)有所不同，病原菌分布不一致，需要根據(jù)當(dāng)?shù)夭『Πl(fā)生情況設(shè)計(jì)相應(yīng)病原菌組合的多重PCR體系。

在多重PCR分子檢測(cè)技術(shù)中，為每個(gè)目的病原菌設(shè)計(jì)出特異性引物，保證各病原菌引物之間沒(méi)有交叉反應(yīng)是成功的關(guān)鍵。另外，引物擴(kuò)增片段的大小應(yīng)存在一定差異，便于區(qū)分。其次，引物濃度對(duì)多重PCR擴(kuò)增也很重要，必須保證所有的引物具有相似的擴(kuò)增效率。

廣西高溫高濕的氣候特點(diǎn)特別有利于多種煙草土傳病害的發(fā)生，以黑脛病和青枯病為主，另外還有立枯病、根腐病、根黑腐病等在局部區(qū)域分布。本研究建立了一種同時(shí)檢測(cè)更多病原菌種類(lèi)的多重PCR方法，能夠同時(shí)檢測(cè)田間病株和土壤中煙草黑脛病菌、青枯病菌、立枯病菌、根腐病菌和根黑腐病菌，對(duì)混合DNA檢測(cè)的靈敏度達(dá)到了100pg/µL，進(jìn)一步提高了檢測(cè)效率，可以更好地服務(wù)于當(dāng)?shù)責(zé)煵蒉r(nóng)業(yè)生產(chǎn)。

本發(fā)明的目的在于提供一種同時(shí)檢測(cè)煙草黑脛病、青枯病、立枯病、根腐病和根黑腐病的引物組、試劑盒及其應(yīng)用，能夠同時(shí)快速檢測(cè)煙草黑脛病菌、青枯病菌、立枯病菌、根腐病菌和根黑腐病菌以及田間帶菌煙草病株和土壤，為田間煙草根莖部病害的早期診斷和有效防治提供依據(jù)。

 本發(fā)明篩選引起五種根莖部病害的病原菌的特異性引物組合，通過(guò)不同的引物濃度和退火溫度對(duì)多重PCR體系進(jìn)行優(yōu)化，檢測(cè)體系的靈敏度，并對(duì)土壤和植株樣品進(jìn)行測(cè)試，驗(yàn)證其實(shí)用性，能夠同時(shí)快速檢測(cè)煙草黑脛病菌、青枯病菌、立枯病菌、根腐病菌和根黑?1腐病菌以及田間帶菌煙草病株和土壤，對(duì)混合DNA檢測(cè)的靈敏度達(dá)到了100pg.µL ，可以為煙草土傳病害以及同種病原菌引起的其他作物病害的快速診斷、早期監(jiān)測(cè)預(yù)警以及防控提供有力依據(jù)，具有較高的應(yīng)用前景。