普魯蘭多糖（Pullulan）是一種由麥芽三糖通過α-1,6-糖苷鍵連接而成的微生物胞外多糖。由于其具有諸多優(yōu)良特性如水溶性、生物降解性、生物兼容性、成膜性以及化學可塑性等，普魯蘭多糖及其衍生物可廣泛應用于食品、醫(yī)藥、化妝品等領域。在日本，普魯蘭多糖作為食品添加劑無使用限制。我們國家于2006年也將普魯蘭多糖批準為食品添加劑新品種。普魯蘭多糖的大規(guī)模工業(yè)化生產是實現其廣泛應用的前提。盡管普魯蘭多糖在1959年被發(fā)現可由出芽短梗霉發(fā)酵生產，但直到70年代才由日本林原生化公司實現規(guī)?；a，并一直壟斷國際市場。國內在90年代才開始相關研究，經過20多年的發(fā)展，雖然取得了較大進展，但在普魯蘭多糖產量、底物轉化率、發(fā)酵周期、以及分子量控制等方面還存在諸多問題。

作為一種高分子聚合物，分子量是影響普魯蘭多糖物理化學性質和應用領域的一個重要因素。普魯蘭多糖分子量主要受到菌種差異、培養(yǎng)基組分、以及發(fā)酵條件的影響。眾多研究人員利用自然選育或誘變選育獲得了多株能夠合成不同分子量普魯蘭多糖的出芽短梗霉，結合發(fā)酵條件控制，普魯蘭多糖分子量最低可到8×104，最高可大于2×106。研究表明不同分子量普魯蘭多糖的應用領域不同，例如用于膠囊制備的普魯蘭多糖分子量要求大于3×105，用于食品保鮮成膜的普魯蘭多糖分子量為2×105，而用作化妝品添加劑和低熱值食品添加劑的普魯蘭多糖分子量則越低越好。此外，在發(fā)酵過程中高分子量普魯蘭多糖引起發(fā)酵液粘度大，尤其在發(fā)酵后期，底物、溶氧和熱量的傳遞受到嚴重限制，從而影響普魯蘭多糖產量，并增加了發(fā)酵工藝能耗。因此，開發(fā)低分子量普魯蘭多糖生產工藝，對于提高普魯蘭多糖的產量、降低生產成本、拓寬普魯蘭多糖應用領域、提高產品附加值具有重要的現實意義。

本發(fā)明的目的是為了克服現有技術的不足，提供一種利用出芽短梗霉發(fā)酵生產超低分子量普魯蘭多糖的方法，本發(fā)明是以出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）GXZ-6，保藏編號為CCTCC NO：M 2017517為生產菌種，利用葡萄糖或蔗糖為底物，30℃條件下，采用分批發(fā)酵方式生產普魯蘭多糖，生產得到的普魯蘭多糖的產量可達110 120 g/L，底物轉化率達78 85%，分子量低至2.5×103 9.0×103，具有發(fā)酵液粘度低、普魯蘭多糖產量和底物轉化率高、以及分子量低的優(yōu)點，極具工業(yè)生產潛力。

一種利用出芽短梗霉發(fā)酵生產超低分子量普魯蘭多糖的方法，包括如下步驟：

（1）菌種活化

將出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）GXZ-6接種于PDA固體斜面培養(yǎng)基（馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，蒸餾水定容至1L，自然pH），25 30℃培養(yǎng)36 48h；所述出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）GXZ-6的保藏編號為CCTCC M 2017517，保藏日期為2017年9月20日，保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址：中國武漢武漢大學；

（2）種子液制備

將整個PDA固體斜面培養(yǎng)基上的菌落接入裝有50mL液體種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，搖床轉速180 220rpm，25 30℃培養(yǎng)36 48h至菌株對數生長中期，以此作為一級種子液；將50mL一級種子液接入裝有250mL液體種子培養(yǎng)基的3L三角瓶中，搖床轉速180 220rpm，25~30℃培養(yǎng)36 48h至菌株對數生長中期，以此作為二級種子液；所述液體種子培養(yǎng)基濃度組成為：葡萄糖80~100g/L，NH4Cl 2~4g/L，KCl 0.5~1g/L，KH2PO4 0.1~0.2g/L，MgSO4·7H2O 0.1 0.2g/L，ZnSO4·7H2O 0.05 0.1g/L，CaCO3 20 40g/L，自然pH，蒸餾水配制；

（3）液體發(fā)酵

將二級種子液按接種量5 15%（v/v）接入裝有液體發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐裝液量為3.5 4L，轉速200 400rpm，通氣量0.5 1vvm，25 30℃發(fā)酵5 7天；所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基濃度組成為：碳源140 160g/L，NH4Cl 3 6g/L，KCl 0.5 1g/L，KH2PO4 0.1 0.2g/L，MgSO4·7H2O 0.1 0.2g/L，ZnSO4·7H2O 0.2 0.4g/L，CaCO3 20 40g/L，琥珀酸 5 10g/L，自然pH，蒸餾水配制；所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源為葡萄糖、蔗糖中的任意一種或其組合；

（4）普魯蘭多糖提取純化及產量測定

將發(fā)酵液離心去除菌體和殘余碳酸鈣，收集上清液并加入2倍體積無水乙醇，輕微攪動后于4℃靜置過夜，離心收集沉淀，冷凍干燥后得到普魯蘭多糖。利用稱重法測定普魯蘭多糖產量。

（5）普魯蘭多糖分子量測定

將提取純化的普魯蘭多糖溶解于蒸餾水中至濃度為10mg/mL，利用凝膠滲透色譜測定普魯蘭多糖分子量，色譜條件：流動相為水，流速1mL/min，進樣量20μL，檢測溫度25℃。采用不同分子量的商品化普魯蘭多糖作為標準對照品。

本發(fā)明的優(yōu)點是：

1、本發(fā)明以出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）GXZ-6為生產菌種，利用葡萄糖或蔗糖為底物，采用分批發(fā)酵方式生產普魯蘭多糖，生產得到的普魯蘭多糖的產量可達110~120 g/L，底物轉化率達78 85%，分子量低至2.5×103 9.0×103，具有發(fā)酵液粘度低、普魯蘭多糖產量和底物轉化率高、以及分子量低的優(yōu)點。相較于已公開的普魯蘭多糖生產技術而言，本發(fā)明的普魯蘭多糖產量和底物轉化率高，有利于降低原料成本，發(fā)酵液粘度低，有利于降低發(fā)酵能耗，而超低分子量的普魯蘭多糖特別適用于化妝品添加劑和低熱值食品添加劑，能夠拓寬普魯蘭多糖應用領域。上述有益效果表明本發(fā)明技術極具工業(yè)生產潛力，并具備顯著的經濟效益。

2、本發(fā)明采用的出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）GXZ-6可在30℃條件下分批發(fā)酵生產普魯蘭多糖，相較于大多數出芽短梗霉25℃發(fā)酵生產普魯蘭多糖而言，能夠大大減少發(fā)酵過程中冷卻水的消耗，這個優(yōu)良特性為工業(yè)化生產提供了有利條件。